【背景介紹】

L-天冬酰胺酶（酶代碼EC3.5.1.1，ASNase）是一種催化天冬酰胺脫氨為天冬氨酸和氨的氨基水解酶。這種酶廣泛應用于成人、兒童急性淋巴細胞白血病和兒童非霍奇金淋巴瘤的治療。L-天冬酰胺酶也用于食品工業，以防止食品在油炸或烘烤過程中形成丙烯酰胺。另外，它也可以作為一種生物傳感器的應用，用于檢測所有化療期間的天冬酰胺水平。對于正常細胞來說，L-天冬酰胺是一種非必需氨基酸，它可以通過天冬酰胺合成酶以必要的量合成。正是這種酶將體內的谷氨酰胺轉化為細胞生長所需的天冬酰胺。相反，白血病細胞缺乏天冬酰胺合成酶，而其惡性生長則需要大量的L-天冬酰胺，因此依賴于血漿中L-天冬酰胺的外源供應。L-天冬酰胺酶可通過水解腫瘤細胞所需的L-天冬酰胺，從而使其饑餓并殺死白血病細胞。天冬酰胺缺乏導致蛋白質合成不足，DNA和RNA合成延遲，從而損害細胞功能，導致癌細胞死亡；由于這種對白血病細胞的選擇性作用，L-天冬酰胺酶被認為是治療ALL的里程碑。

L-天冬酰胺酶可以用不同的細菌、真菌、酵母和放線菌等組織合成。在目前的情況下，臨床上有三種L-天冬酰胺酶制劑，即來自大腸桿菌的天冬酰胺酶、菊歐文氏桿菌和聚乙二醇化大腸桿菌。臨床配方的L-天冬酰胺酶對谷氨酰胺、尿素有親和力，而且酶的半衰期降低了；因此，患者表現出特殊的過敏反應。因此，尋找特異性高、過敏反應低的L-天冬酰胺酶是研究者面臨的一個特殊挑戰。為了去除這些副產品，必須對產品進行高純度的純化。目前正在進行廣泛的研究，以尋找細菌種類的有效替代物，并生產不含谷氨酰胺酶和尿素酶的L-天冬酰胺酶。

在任何工業中，酶生產的主要關注點是其低穩定性和低活性的特點；因此，固定化技術的使用有助于提高任何工藝的生產率。通常，根霉可以在以葡萄糖為碳源的簡單培養基中生長，但由于菌絲生長導致培養基粘度增加，因此用絲狀真菌發酵較為復雜。全細胞固定化是一種將細胞限制在空間內而不喪失其生物活性的技術。細胞可以用不同的物理或化學方法支撐在固體基質結構上；最常用的技術是夾帶整個細胞，這種技術被稱為生物包膜或微膠囊化。Tay和Yang報道了在旋轉纖維床生物反應器中固定化米根霉細胞用于乳酸生產，可以實現幾乎無細胞發酵，并且比懸浮真菌細胞提供更高的產量。這種技術的使用還減少了酶的提取和純化所需的時間，因為被固定化的整個細胞具有更好的反應能力。使用何種固定化技術的決定取決于所用細胞的性質、其與固體載體的反應性以及所生產材料的類型。印度理工大學的Devarai等人通過用海藻酸鈣（Ca-alginate）珠包埋全細胞根霉小孢子IBBL-2生產L-天冬酰胺酶。研究了海藻酸鈉溶液濃度、小球大小等因素對酶活性的影響。該實驗結果發表不久前發表在3 Biotech期刊上。（https://doi.org/10.1007/s13205-019-1883-5）

Spinchem旋轉床反應器（RBR）是一種填充有固相的填料床，在其研究案例中，固相是含有微生物的固定化珠。該反應器基于離心加速度工作，這有助于增強在反應器中發生的混合和傳質操作。使用該反應器進行過程強化，不僅降低了過程的經濟性，而且增加了總產量。在RBR中，培養基通過包裝，在固定化材料內進行培養基與微生物之間的發酵過程，酶作為輸出被釋放。由于轉子中的小球很致密，與自由流動的液體相比，整體應力降低，這有助于提高酶的活性。同時，作者也采用200mL和1L的RBR進行了放大研究，以證明該工藝的有效性。實驗的裝置如圖1所示。

圖1 實驗裝置和程序示意圖

【實驗過程】

pH值的影響

采用單因素一次法對各因素的工藝效率進行了分析。為了使微生物正常生長，必須確定每一個參數；任何低于或高于最佳值的值都會對微生物的生長產生不利影響。在30℃的溫度下生產l-天冬酰胺酶。IBBL2在MCD培養基上生長，培養基的pH值在4-8之間。pH值對L-天冬酰胺酶的影響如圖2A所示，小根霉菌IBBL-2在微酸性pH下表現出更好的活性，活性曲線表明酶釋放或微生物生長在實驗的第二天和第三天之間迅速上升，其最大活性出現在第三天。結果表明，在pH為6時，酶活力最高，活性為11.69U?mL-1。然而，在低pH（4和5）和高pH范圍（8-9）時，天冬酰胺酶活性都很低。

溫度的影響

培養溫度對發酵過程中微生物的生長和酶的產生有著深刻的影響。用預先優化的pH值在15-50℃范圍內研究了溫度對L-天冬酰胺酶活性的影響。L-天冬酰胺酶活性和不同溫度下的比活性如圖2b所示。當前的研究表明，小根霉IBBL-2生長的最適溫度為30℃，在此溫度下最大活性為12.2 U?mL-1，比活力為19.29 U?mg-1。在低溫和35℃以上的高溫下均觀察到L-天冬酰胺酶活性的下降。

初始孢子濃度的影響

作為微生物生長接種物，所添加的初始細胞數是另一個需要研究的重要因素。初始值越低，微生物的生長就越不正常，而初始值越大，微生物的生長就越擁擠，導致初始生長所需的養分缺乏。初始孢子濃度對小孢子菌IBBL-2產生L-天冬酰胺酶的影響如圖3A所示，目前的研究表明，在每毫升4×10⁶個細胞濃度下，獲得的最大L-天冬酰胺酶活性為12.02 U?mL-1。

圖2微孢子根霉IBBL-2在不同pH（a）和溫度（b）條件下的液體發酵l-天冬酰胺酶活性和比活力

圖3利用微孢子根霉IBBL-2分別改變微生物細胞初始濃度（a）和金屬離子類型（b）的液體發酵中的l-天冬酰胺酶活性和比活性

金屬離子效應

影響微生物生長的另一個因素是金屬離子，根據其對微生物生長的影響，金屬離子可以促進或減少微生物的生長，也可以作為幾種生物合成酶的共同因子。從實驗結果看，Cu2+對生長有積極的影響，其最大活性為13.92 U?mL-1，如圖3b所示。在測試的金屬離子中，當在MCD培養基中添加Na+金屬離子時，酶活性最低。

碳氮源效應

使用各種碳源（葡萄糖、果糖、淀粉、乳糖和蔗糖）對L-天冬酰胺酶生產影響如圖4a所示。微生物的生長受正在供應的營養源的控制。碳源是任何微生物發育的主要因素。以葡萄糖為碳源，小孢子根霉菌IbBL-2的最大活性為14.43μU?mL-1。從圖4a可以確定，小根霉IBBL-2與葡萄糖的配伍性最好，以蔗糖或果糖為唯一碳源時，L-天冬酰胺酶活性下降。

通過添加氮源（天冬酰胺、谷氨酰胺、蛋白胨、酵母抽提物、硝酸鈉和硫酸銨）研究了氮化合物對微孢子蟲IBBL2產l-天冬酰胺酶的影響。氮源為生長所需蛋白質的生產提供物質。如圖4b所示，微孢子根霉IBBL-2菌株對L-天冬酰胺具有更高的親和力（L-天冬酰胺酶活性14.18 U mL-1）。酵母抽提物也能夠支持L-天冬酰胺酶的大量生產。以硝酸鈉為氮源時，L-天冬酰胺酶活性最低。作者又通過Taguchi OA 方法進一步優化了實驗條件，當固定化海藻酸鈉濃度為3%，細胞珠體大小為2mm時，反應效果最好。

圖4 利用微孢子根霉IBBL-2分別改變微生物碳源（a）和氮源（b）的液體發酵中的l-天冬酰胺酶活性和比活性

大規模生產L-天冬酰胺酶

采用優化的培養基組成和最佳條件（pH6.0，30°C，接種量25ml，3%的固定化材料濃度，2mm大小的珠體），在錐形瓶和固態托盤生物反應器中進行了L-天冬酰胺酶的實驗室規模生產。在本研究中，制備了200ml和1l容量的合成培養基，并用RBR對固定化海藻酸鈣珠進行了反應。由所得結果可知，活性值與燒瓶研究所得值相近。圖5所示的實驗室規模RBR研究獲得的活性為200mL 實驗組為20.21 U m L-1 、1L實驗組為19.13 U m L-1。固定化酶活性的增加歸因于細胞的穩定性增加。這導致了介質的穩定輸入和產品的輸出；同時，由于剪切力是細胞中可能發生的損傷的原因。而在RBR介質的流動中，細胞不受任何剪切力的影響，進而受到保護。

圖5 半中試擴大培養中，酶活（a）和比活性（b）在200ml和1L的比較

【實驗結論】

1. 在固定溫度下，以葡萄糖為碳源，L-天冬酰胺為氮源，以Cu為附加金屬離子，在30℃、pH為6、初始微生物濃度為4×10⁶個細胞每mL的條件下使用3%（W/V）濃度下制備的粒徑為2 mm珠體進行培養，小孢子根霉菌iBL-2真菌的最大活性為17.68 U mL-1。比未固定化的活性增加了1.4倍。

2. 且作者通過放大研究表明，生產酶活性在200mL級旋轉床反應器和1L級旋轉床反應器的放大過程中沒有損失。

3. 小根霉IbBL-2能產生不含谷氨酰胺酶和脲酶的L-天冬酰胺酶，從而取代了現有的利用細菌種類的生產。它在固定化技術的應用中也顯示出良好的穩定性。

文獻原文：https://doi.org/10.1007/s13205-019-1883-5

l?Asparaginase production in rotating bed reactor from Rhizopus microsporus IBBL?2 using immobilized Ca?alginate beads

【一正科技簡介】

作為荷蘭Chemtrix微通道反應器（適合液液氣液快速反應），英國AM連續多級攪拌反應器（適合氣液固多相慢反應），瑞典SpinChem旋轉床反應器（酶催化，固定化酶，催化劑需要回收的反應），澳大利亞CSIRO催化劑固定化連續反應器（適合催化劑固定的連續流反應），比利時Creaflow光催化反應器（氣液固光催化反應），英國C-Tech電化學連續反應器，英國Nitech連續結晶器，德國CINC連續萃取分離器，英國AWL連續過濾器在中國區的獨家代理商和技術服務商，深圳市一正科技有限公司為廣大高校和企業提供連續合成、在線萃取、連續結晶、在線過濾干燥、在線分析等整套連續工藝解決方案。

公司與復旦大學、南京大學、中山大學、華東理工大學、南京工業大學、浙江工業大學、河北工業大學等高校研究機構合作成立微通道連續流化學聯合實驗室，致力于推動連續流工藝在有機合成、精細化工、制藥行業、能源材料、食品飲料等領域的應用，合作實驗室可以為客戶的傳統間歇釜式工藝在連續流工藝上的轉變提供工藝驗證、連續流工藝開發工作，促進制藥及精細化工企業由傳統間歇工藝向綠色、安全、快速、經濟的連續工藝轉變。

公司與荷蘭Chemtrix B.V.在浙江臺州、江蘇南京合作組建了連續流微通道工業化應用技術中心（以下簡稱“工業化技術中心”），旨在打造集連續流微通道工藝開發、中試試驗、工業化驗證、技術交流于一體的綜合性連續流微通道應用技術服務中心，以為廣大生物醫藥企業、化工類企業提供專業、完善的智能化連續流工藝整套系統解決方案及一流的技術服務方案。

公司網址：www.nengren.cc

聯系電話：0755-83549661 

產品熱線：400-0755-403

應用原文及附件請下載下方PDF文件：

l?Asparaginase production in rotating bed reactor from Rhizopusmicrosporus IBBL?2 using immobilized Ca?alginate beads