【課題背景】

酶作為生物催化劑在醫藥、精細化工、香料、維生素、食品和紡織工業中被廣泛使用。過去幾十年中，生物催化劑因其環境友好、安全、良好的化學、區域和立體選擇性而得到廣泛應用。不過，酶的工業應用仍面臨著嚴峻的挑戰。在工業規模上，酶所要面對的一些問題主要在于長期操作的穩定性、活性、反應產物的抑制、對化學反應的選擇性、回收率、可重復使用性、易操作性以及在成本上的一些考量。

為了克服這些問題，人們發展了多種技術，如酶固定化，即在不同載體上經過吸附、共價鍵合、親和性、離子交換等方法將酶固定化，可大大增強過程控制和穩定性，優化存儲和操作條件，并大大簡化了回收過程，從而降低了操作成本。

在實際生產過程中，為了簡化固定化酶回收過程，提高生產效率，節約生產成本，反應條件的優化和反應器的改進必不可少。工業上廣泛使用的是攪拌槽反應器，由于攪拌槳的攪拌作用，經常遇到固定化酶的機械磨損的問題。這種機械磨損效應會導致其固定化骨架磨損，形成難以去除的粉狀顆粒，并在回收時導致酶的損失。在這種情況下，問題就會變得比較復雜，并影響工業規模上反應的再現性。

為了避免機械應力作用，瑞典SpinChem公司開發了一種新型的旋轉床反應器，它結合了流化床反應器和攪拌槽反應器的優點。如圖1，它由機械攪拌軸和四室旋轉流動池催化劑室組成，使用時將固定化酶裝填到催化劑室即可。由于離心力的作用，反應物反復通過固定化酶，保證了填充床傳質的有效性，既保證了酶免受剪切力和研磨的破壞，也確保了酶載體的穩定性，簡單瀝水就可以快速回收酶無需過濾，大大簡化了回收過程，提高了回收效率。

圖1 SpinChem旋轉床反應器

SpinChem旋轉床反應器被廣泛應用，例如，在固定化轉氨酶催化的反應中，Bornscheuer等人證明了旋轉床反應器技術的應用使酶的重復利用更加方便。脂肪酶催化的分子內胺化反應也有報道。近日，阿斯利康的Subhash Pithani等人使用SpinChem的技術，比較和驗證了旋轉床反應器在藥物構建塊和原料藥工藝開發和制造中的應用。作為本研究的模型反應，選擇了最近發表的諾維信435催化的（順式）-異丙基3-氨基環己酸酯的乙?；磻▓D2所示），該反應在普通釜式反應下以高產率和對映選擇性合成酰胺2。用旋轉床反應器技術代替原有工藝，考察了攪拌速度、溫度以及酶的易回收性對反應的影響。并使用最佳條件來評估了反應的放大能力。

圖2 諾維信435催化的乙酰化反應

【材料和方法】

所有的材料和溶劑都是從供應商直接購買使用，沒有進一步純化。諾維信 435購自丹麥諾維信A/S(酶活性9000 PLU/g)。Spinchem RBR S2(最多28毫升樹脂體積)，RBR S3(最多69毫升樹脂體積)體積)，RBR S4(最大可達0.8 L樹脂體積，3D打印定制)反應器，漂萊特 CalBimmo5587，5872，8285，CalB ImmoPlus和Immozyme IMMCALB-T2-150X固定化脂肪酶分別由漂萊特科技和ChiralVision B.V.公司生產，最終由SpinChem公司固定在催化劑盒中。所有反應均在N2氛圍中進行。條件優化采用150 mL規模在配有機械攪拌頭的SpinChem旋轉反應器RBR S2。放大反應分別采用1000 mL規模（SpinChem旋轉反應器RBR S3）和10L規模SpinChem旋轉反應器RBR S4，3D打印定制）。

所有的轉化率都是通過對粗反應混合物的核磁共振分析記錄下來的?；衔?的對映體純度由手性高效液相色譜法測定[（Lux C2 column (4.6 ×150 mm），120bar CO2氛圍下的15% 2-丙醇作為洗脫劑]。核磁共振測量采用Bruker Avance IIl光譜儀。FT-IR測量采用配有DiComp (diamond) FT-IR探針的React IR 15（Mettler Toledo）。

【實驗部分】

(1S,3R)-異丙基3-乙酰氨基環已環羧酸酯2(循環實驗15g規模)

諾維信435（在大孔丙烯酸樹脂上固定化的南極假絲酵母脂肪酶B，(活性9000 PLU/g)）購自諾維信。將諾維信 435催化劑粉盒(共含1.5 g酶)安裝到配有溫度和FTIR探頭的SpinChem 旋轉床反應器RBR S2上。用氮氣沖洗催化劑室，在室溫下充入無水異丙酸(150ml)。在注射加入(順)-異丙基3-氨基環己內酯(1)(15 g. 77.73 mmol)之前，反應器系統先脫氣并回填氮氣3次，然后加熱至50oC。反應混合物在50oC下以500rpm攪拌，并用IH NMR和在線FT-IR對反應過程進行監測。在達到期望的轉化率后，用強力攪拌將反應混合物簡單地從反應器中抽出，用無水異丙酸(50 ml)沖洗諾維信435酶催化劑室。用同一批酶，重復9次實驗過程。

對映體超量分析取樣:收集每個批次反應混合物2ml，依次用HCl水溶液(2mL) 和飽和NaHCO3水溶液(2mL)萃取有機層，濃縮后用手性高效液相色譜法分析。

(1S,3R)-異丙基3-乙酰氨基環己內酯2 (1kg規模)

在氮氣氛圍下向10L的SpinChem旋轉床反應器RBR中加入諾維信435 (100 g)。用氮氣對旋轉床反應器進行沖洗，加入10L無水異丙酸，在強攪拌條件下用氮氣脫氣三次。先將反應器加熱至50℃，再通過漏斗在氮氣氣氛下添加(順) 3-氨基環己內酯(1000 g. 5.18 mol)。在50℃下攪拌60min后，將反應混合物排出，用乙酸異丙酯(4L)沖洗酶催化劑室。用4 L草酸溶液(140 g. 0.30 eq. 1.55 mol)洗滌復合有機層，用乙酸異丙酯(3 x 1L)萃取酸性水層，用2 L飽和Na2CO3水溶液洗滌復合有機層。先用2L鹽水沖洗有機層，然后進行拋光過濾(濾芯Demicap Proclear PP, 10.0 um)和濃縮，得到粗產品目標化合物88% ee的白色固體(530 g， 98.7% w/w， 2.33mol，校正收率45%)。在上述粗產品中加入TBME (3L)和庚烷(7L)，得到的泥漿被加熱到70-80℃，攪拌直到完全溶解。將得到的澄清溶液連續攪拌過夜緩慢冷卻至室溫(5℃/h)進行結晶，過濾。用冷TBME/庚烷混合物(3:7混合物，200mL)清洗白色固體結晶。40℃減壓干燥后，得到白固體的形式的目標化合物2 (460 g. 99% w/w，2.02 mol. 產率39.1%，ee > 98.8%）。

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【阿斯利康案例】使用SpinChem RBR旋轉床反應器進行固定化酶促反應