【Ingenza案例】當“連續流技術”遇上“生物催化”：高效生產手性氨基酸

【背景介紹】

生物催化是一種利用酶或者生物有機體做為催化劑進行化學轉化的技術，由于其作用條件綠色、溫和，并且對反應底物具有高效的選擇性，因此在有機合成特別是手性分子的合成中具有獨特的優勢，是近年來綠色有機化學合成技術研究的熱點之一。

生物催化為什么可以如此高效的實現反應的立體選擇性的呢？這與生物催化反應的本質有關。我們都知道，酶的化學本質是蛋白質，而蛋白質是具有一定構象的。因此，在生物反應中，首先需要酶與小分子底物結合，而這則需要小分子的底物與酶提供的催化位點的構象十分吻合。這就好像是一把“鑰匙”配一把“鎖”一樣，符合催化位點結構的底物就可以進入到酶的催化口袋中，就像鑰匙開啟了一把鎖一樣，催化反應就會啟動。而結構不匹配的底物就像是一把錯誤的鑰匙，無法被酶催化。而當參與反應的多種底物均與酶結合后，由于酶限制了這些底物的相對空間位置，因此這些底物只能按照特定的空間方向進行反應。這就體現了酶催化化學反應中的立體選擇性。

酶催化反應一般通過拆分法或者轉化法得到光學純的化合物。拆分法(Biocatalytic Resolution)是利用酶對于外消旋體中一對對映構識別結合能力不同進行拆分的（如圖1a）。比方說在非天然氨基酸（UAAs）的合成中，氨基酸根據α-碳原子的手性不同，分為D-氨基酸和L-氨基酸。氨基酸消旋體（D:L=50:50）是很易制得的，可通過D-氨基酸氧化酶從消旋體拆分出其中的非天然L-氨基酸。因為D-氨基酸氧化酶只能識別D-氨基酸，將其氧化為α-酮酸，而不能與L-氨基酸發生反應。因此，通過D-氨基酸氧化酶的選擇性拆分，就將氨基酸的外消旋混合物轉化為酮酸和L-氨基酸的混合物，而這種混合物相較于一對異構體往往是更易于分離的。即通過這樣的方式，將非天然的L-氨基酸從消旋體中拆分出來（如圖1a）。

圖1. 生物催化反應獲得手性異構體的三種方法：a) 拆分法、 b)不對稱拆分法和 c)轉化法.

而拆分法分離得到的光學純異構體往往最高也只具有50%的收率，而另外50%往往被轉化成其他副產物（α-酮酸）被浪費掉了，如果我們建立一種從副產物重新回到消旋體的一種策略，即實現了對異構體的動態動力學拆分（Dynamic Kinetic Resolution, DKR），可以有效的把拆分的理論產率提高到100%。比方說在D-氨基酸氧化酶對氨基酸的拆分中，所產生的酮酸可以在鈀/碳的催化下被甲酸銨還原形成DL-氨基酸[2]。而其中的D-氨基酸可以繼續被D-氨基酸氧化酶選擇性的氧化生成酮酸，這樣形成的循環，就可以把消旋化合物全部轉化為光學純的L-氨基酸異構體（如圖1b所示）。

通過酶催化轉化（Biotransformation）的方法得到光學純的化合物也是一種常用的方法。該方法是利用酶對于潛手性底物（achiral substrate）的不對稱催化從而得到的光學純異構體。例如在非天然氨基酸的合成中，轉化法的應用也很常見。酮酸就是一種合成非天然氨基酸的潛手性底物，L-氨基酸酸可以通過對酮酸的不對稱轉氨化制備而得（如圖1c所示）。比方說L-高丙氨酸可以通過2-氧代丁酸和芐胺為起始原料，在ω-轉氨酶的不對稱催化下合成，引入己烷作為反應溶劑形成雙相體系可減少苯甲醛對酶的活性抑制，該反應產率96%，e.e. >99%[3]。

生物催化由于其高效的選擇性，在不對稱催化合成領域具有很大的價值。但由于其較長的反應停留時間與多相反應的特點，限制了其在連續流反應中的應用。而Coflore ATR連續多級攪拌反應器，作為一種動態混合攪拌器，依靠攪拌器元件和反應器本體的機械振動進行混合，不借助流體速度，就可以提供非常高效的混合效率，可以有效的解決連續流反應中反應時間長又存在固體的問題，進而有效地應用于酶催化反應中。

【連續流方案】

工業生物技術專家Ingenza在Roslin的生物中心與英國AM technology公司合作將Coflore ATR連續多級攪拌反應器運用于生物催化反應，實現了對手性氨基酸的高效大規模的合成。相關成果發表在Org. Process Res. Dev.（dx.doi.org/10.1021/op2003612）雜志上。

D-氨基酸氧化酶拆分氨基酸是一個三相反應（如圖1a所示），需要向丙氨酸溶液（液相）中，通入氧氣（氣相）氧化FAD輔酶循環，D-氨基酸氧化酶的全細胞凍干粉在反應體系中又是一個固體（固相）。并且這個反應需要充分攪拌幾個小時才可以完成。由此看來，Coflore ATR連續反應器是適合于進行此類反應的。該反應在1 mol/L的底物濃度條件下進行（相當于丙氨酸89.09 g/L）。首先將丙氨酸和酶懸濁液預混，再泵入ATR反應器中，接著再將氧氣鼓入反應管中（大規模反應中則使用多個反應管，氧氣則根據比例在反應流的不同階段鼓入，反應裝置如圖2所示），保持2Hz的反應振速，考察了連續流反應的生物轉化反應速率，并與釜式反應的效果進行了對比。

圖2. Coflore ATR反應器的混合原理、裝置以及氣液混合圖. 圖片來源：Org. Process Res. Dev.

釜式反應進行三相反應，其反應的效果往往和氣體的傳質效率有很大的關系。比方說在此例反應中，轉速和反應體積對反應的結果非常大。轉速加快，氧氣的傳質效率高，反應的速度也會明顯加快。而當反應的規模增大時，反應液的高度會有明顯的變化，會改變釜式反應中氣液分布降低其混合效率，進而使反應速度大大的降低，并且反應中酶的降解導致的反應活性降低也是不容忽視的（可能與產生的雙氧水的蛋白毒性有關，如圖3所示）。因此，釜式反應很難放大，這極大降低了其應用價值。

圖3. 釜式反應中轉速與規模對于反應速率的影響. 圖片來源：Org. Process Res. Dev.

而Coflore ATR 連續多級攪拌反應器是通過增加管道長度來擴大反應規模，這不會改變混合兩相中的氣液分布。又因其高效的攪拌混合效率，使得在同等1L的反應規模下，連續流是釜式反應速率的三倍，當增大到10L反應時，連續流反應的速率基本上不發生改變，并且節約了70%的氧氣（如圖4所示）。而且相對于普通的靜態混流反應器而言，Coflore ATR 連續多級攪拌反應器保持了在長時間反應進程中一個很好的壓力降，并且避免了物料的堆積和堵塞，其對于反應物的高混合效率依舊是其他類型反應器無法比擬的。

圖4. 大規模反應對于連續流反應和釜式反應效果的影響. 圖片來源：Org. Process Res. Dev.

【實驗結論】

1. D-氨基酸氧化酶拆分氨基酸，其反應速率與氧的吸收速率有很大關系，Coflore ATR 連續多級攪拌反應器解決了傳統釜式反應中混合效率低和保持氣液分布的均勻性的難題。行而有效的擴大了反應規模。

2. 生物催化中酶的固體特性限制了其在連續流技術的使用，Coflore ATR 連續多級攪拌反應器高效的動態橫向混合使得全細胞催化與連續流技術在工業生產中的聯用成為可能。其避免了活細胞等有機體在設備中的堵塞問題，并提高了反應規模和反應速度。

3. 生物催化與連續流技術的聯合應用有助于降低工業生產中設備成本、操作成本和催化劑消耗，加快生產速度，具有深遠而富有前景的應用意義。

【參考文獻】

[1] dx.doi.org/10.1021/op2003612 | Org. Process Res. Dev. 2012, 16, 1013?1016

[2] US20080153137

[3] Biotechnol. Lett. 2009, 31, 1595-1599

深圳市一正科技有限公司，作為荷蘭Chemtrix公司（微通道反應器）、英國AM公司（連續多級攪拌反應器、催化加氫系統）、英國NiTech公司（連續結晶儀、連續合成儀）在中國區的獨家代理商和技術服務商，為廣大高校和企業提供連續合成、在線萃取、連續結晶、在線過濾干燥、在線分析等整套連續工藝解決方案。

公司與復旦大學、南京大學、中山大學、華東理工大學、南京工業大學、浙江工業大學、河北工業大學等高校研究機構合作成立微通道連續流化學聯合實驗室，致力于推動連續流工藝在有機合成、精細化工、制藥行業、能源材料、食品飲料等領域的應用，合作實驗室可以為客戶的傳統間歇釜式工藝在連續流工藝上的轉變提供工藝驗證、連續流工藝開發工作，促進制藥及精細化工企業由傳統間歇工藝向綠色、安全、快速、經濟的連續工藝轉變。

公司與荷蘭Chemtrix B.V.在浙江臺州、江蘇南京合作組建了連續流微通道工業化應用技術中心（以下簡稱“工業化技術中心”），旨在打造集連續流微通道工藝開發、中試試驗、工業化驗證、技術交流于一體的綜合性連續流微通道應用技術服務中心，以為廣大生物醫藥企業、化工類企業提供專業、完善的智能化連續流工藝整套系統解決方案及一流的技術服務方案。

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