【阿斯利康案例】使用SpinChem RBR旋轉床反應器進行固定化酶促反應

背景介紹

酶作為生物催化劑在醫藥、精細化工、香料、維生素、食品和紡織工業中被廣泛使用。過去幾十年中，生物催化劑因其環境友好、安全、良好的化學、區域和立體選擇性而得到廣泛應用。不過，酶的工業應用仍面臨著嚴峻的挑戰。在工業規模上，酶所要面對的一些問題主要在于長期操作的穩定性、活性、反應產物的抑制、對化學反應的選擇性、回收率、可重復使用性、易操作性以及在成本上的一些考量。

為了克服這些問題，人們發展了多種技術，如酶固定化，即在不同載體上經過吸附、共價鍵合、親和性、離子交換等方法將酶固定化，可大大增強過程控制和穩定性，優化存儲和操作條件，并大大簡化了回收過程，從而降低了操作成本。

在實際生產過程中，為了簡化固定化酶回收過程，提高生產效率，節約生產成本，反應條件的優化和反應器的改進必不可少。工業上廣泛使用的是攪拌槽反應器，由于攪拌槳的攪拌作用，經常遇到固定化酶的機械磨損的問題。這種機械磨損效應會導致其固定化骨架磨損，形成難以去除的粉狀顆粒，并在回收時導致酶的損失。在這種情況下，問題就會變得比較復雜，并影響工業規模上反應的再現性。

為了避免機械應力作用，瑞典SpinChem公司開發了一種新型的旋轉床反應器，它結合了流化床反應器和攪拌槽反應器的優點。如圖1，它由機械攪拌軸和四室旋轉流動池催化劑室組成，使用時將固定化酶裝填到催化劑室即可。由于離心力的作用，反應物反復通過固定化酶，保證了填充床傳質的有效性，既保證了酶免受剪切力和研磨的破壞，也確保了酶載體的穩定性，簡單瀝水就可以快速回收酶無需過濾，大大簡化了回收過程，提高了回收效率。

圖1 SpinChem旋轉床反應器

SpinChem旋轉床反應器被廣泛應用，例如，在固定化轉氨酶催化的反應中，Bornscheuer等人證明了旋轉床反應器技術的應用使酶的重復利用更加方便。脂肪酶催化的分子內胺化反應也有報道。近日，阿斯利康的Subhash Pithani等人使用SpinChem的技術，比較和驗證了旋轉床反應器在藥物構建塊和原料藥工藝開發和制造中的應用。作為本研究的模型反應，選擇了最近發表的諾維信435催化的（順式）-異丙基3-氨基環己酸酯的乙酰化反應（圖2所示），該反應在普通釜式反應下以高產率和對映選擇性合成酰胺2。用旋轉床反應器技術代替原有工藝，考察了攪拌速度、溫度以及酶的易回收性對反應的影響。并使用最佳條件來評估了反應的放大能力。

圖2 諾維信435催化的乙?；磻?/span>

實驗條件優化

本文利用SpinChem旋轉床反應器對圖2中的反應條件進行了優化。首先根據轉化率和對映體選擇性及反應速率對20種固定化酶進行了篩選，最終選擇諾維信435固定化脂肪酶，其實現預設的50%轉化率所需時間為6 h，對映體選擇性為90% ee。在SpinChem旋轉床床反應器RBR S2中對其裝載效應進行了考察，反應條件20oC，500 rpm，酶載量10% wt/wt條件下，反應速率最快（6 h實現50%的轉化率）。兼顧反應速率和渦流技術實現的便利性，選擇500 rpm為最佳攪拌速率。在不影響對映選擇性的情況下，隨著反應溫度的升高，轉化率達到45-50%的時間明顯縮短，選擇50oC作為下一步循環實驗的最佳溫度。

回收實驗：

在優化的反應條件下，通過循環實驗對固定化酶的重復使用性進行了評價。通過在線FT-IR連續監測（圖3），在50oC的反應溫度、10%的諾維信435負載和500 rpm的攪拌速率下，使用同一批次的酶執行10個循環。每次循環實驗結束后，簡單地排出反應混合物，并在下一次循環實驗之前向旋轉床反應器中注入反應物。發現固定化酶在這些條件下非常穩定，可以連續進行10次循環實驗反應，反應速率和酶的對映選擇性（90% ee，圖3和4）保持得都很好。值得一提的是，即使在10個周期后，諾維信435仍然具有很高的催化活性，并且保持與第一個周期后獲得的一樣好的對映選擇性。

圖3 在SpinChem RBR S2中使用諾維信435對乙?；始皩τ丑w選擇進行循環實驗，共10個循環

圖4 FT-IR在線觀察SpinChem旋轉床反應器中目標反應的轉化率

放大實驗：

利用優化后的反應條件，對反應的可放大性進行了評價。從使用150mL SpinChem RBR旋轉床反應器的小規模實驗開始，進一步將反應放大到1L（SpinChem旋轉床反應器RBR S3）和10 L（SpinChem旋轉床反應器RBR S4）。令人滿意的是，在所有三種規模下都觀察到了一致的反應速率和對映選擇性（圖6）。

圖5  (左)反應器設置與在線FT-IR監測和(右)SpinChem旋轉床反應器RBRS4(10升)

在1000 g的規模(SpinChem旋轉床反應器RBR S4 10L)，酶負荷為10% wt/wt，底物負荷為100 g/L，反應成功進行放大。在50℃條件下，90 min內反應轉化率達到46%，經過酸性水處理和結晶后，得到了總收率為39%，98.8% ee的目標化合物。

圖6 反應放大的效果

結論

為使固定化酶用于醫藥和大宗化學品實際生產及實現經濟價值，不僅需要酶保持高催化活性，還需要底物到活性位點之間有高效的傳質速率。而且酶的固定化成本通常比較高，只有進一步延長酶的重復使用周期，才能降低生產成本及運營費用。

固定化酶的再利用程度取決于酶在工藝條件下的穩定性，載體的完整性和由于機械應力造成的磨損程度，檢測及大規?；厥盏谋憷?。

本文用SpinChem RBR旋轉床反應器技術證明了諾維信435固定化酶參與的1乙?；磻目尚行?，有效保證了對映選擇性和反應速率。此外，同一批酶可重復使用多達10個循環，不僅催化活性損失非常小，而且無需過濾，即可快速回收固定化酶，本文還對其生產放大進行了研究，利用SpinChem旋轉床反應器可以從100 mL實驗室規模直接放大到10 L的中試及更大的生產規模，為實際規?；a提供了可行性依據。

參考文獻：

DOI: 10.1021/acs.oprd.9b00240

Using Spinchem? RBR Technology for Immobilized Enzymatic Reactions: A Case Study

Subhash Pithani, Staffan Karlsson, Hans Emten?s, and Christopher ?berg， Org. Process Res. Dev， Publication Date (Web): 24 Jul 2019

公司簡介

深圳市一正科技有限公司，作為荷蘭Chemtrix公司（微通道反應器）、英國AM公司（連續多級攪拌反應器、催化加氫系統）、瑞典SpinChem公司（旋轉床反應器）在中國區的獨家代理商和技術服務商，為廣大高校和企業提供連續合成、在線萃取、連續結晶、在線過濾干燥、在線分析等整套連續工藝解決方案。

公司與復旦大學、南京大學、中山大學、華東理工大學、南京工業大學、浙江工業大學、河北工業大學等高校研究機構合作成立微通道連續流化學聯合實驗室，致力于推動連續流工藝在有機合成、精細化工、制藥行業、能源材料、食品飲料等領域的應用，合作實驗室可以為客戶的傳統間歇釜式工藝在連續流工藝上的轉變提供工藝驗證、連續流工藝開發工作，促進制藥及精細化工企業由傳統間歇工藝向綠色、安全、快速、經濟的連續工藝轉變。

公司與荷蘭Chemtrix B.V.在浙江臺州、江蘇南京合作組建了連續流微通道工業化應用技術中心（以下簡稱“工業化技術中心”），旨在打造集連續流微通道工藝開發、中試試驗、工業化驗證、技術交流于一體的綜合性連續流微通道應用技術服務中心，以為廣大生物醫藥企業、化工類企業提供專業、完善的智能化連續流工藝整套系統解決方案及一流的技術服務方案。

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