【Purdue案例】液滴加速反應篩選法指導地西泮的多步連續流合成及對反應機理的快速質譜分析研究

眾所周知，質譜（MS）對于反應監測方面有著大的用途，其在監測反應動力學以及反應結果方面具有優良的特性，并且MS也有助于識別反應中間體，從而了解化學反應的機理細節。此外，質譜還可以用來研究液滴中的化學反應。以往的研究表明，在電噴霧電離（ESI）形成的微滴中，大多數化學反應的反應都比相應的本體反應速率加快。這種加速現象產生的一部分原因是溶劑蒸發及其對界面處試劑濃度的所帶來的影響。這種快速反應的現象可作為篩選方法用于指導微流體與大量反應。利用微滴研究化學反應的另一種方法是利用萊登弗羅斯特效應（Leidenfrost effect）。其原理是當液滴接近被加熱的表面時，溶劑開始蒸發，在液滴周圍形成一層隔絕蒸汽層。這層防止了溶劑的快速蒸發，并導致液滴懸浮。盡管通過該技術形成的液滴比ESI液滴大，但它們具有一些相同的性質；因此，該液滴中的反應也可以成為指導微流體反應的有效工具。

Purdue大學的H. Thompson教授2017年通過使用地西泮的合成（圖1）作為模型系統來說明液滴篩選如何指導地西泮的連續合成，相關成果發表在Org. Process Res. Dev.期刊上。由于其途徑中的一個關鍵步驟涉及N-酰化，因此該成果也可能可以用于指導合成普通生物活性分子中的N-酰化反應，因此具有更深遠的意義。雖然微滴中的反應條件并不總是可以直接等同于為微流體級的反應條件，但該方法仍可以作為一種快速的判斷預測工具，以預測該條件下，反應在生產級微流體體系中發生的可能性。流動化學系統，再加上ESI-MS的在線監測，能夠通過實時反饋快速篩選反應條件。這不僅使原料藥的合成更加簡便、高效，而且也為人們對反應機理和副產物形成的新認識提供了可能。地西泮可以通過兩步合成獲得，從5-氯-2-（甲胺基）二苯甲酮（1）與2-鹵乙酰氯（2）的N-?；磻_始，得到酰胺（3）。隨后用氨水處理，然后進行環化，得到地西泮4（圖1）。對于在液滴中篩選或在流動反應系統中檢查每個反應，通過ESI-MS分析立即確定結果。

圖1 地西泮的兩步合成

N-?；磻Y選。反應篩選從ESI液滴、萊登弗羅斯特液滴、大量反應和流動反應系統中的N-酰化步驟開始。最初的ESI噴霧（脫機）反應在多個溶劑[二甲基乙酰胺（DMA），四氫呋喃（THF），二甲基甲酰胺（DMF），乙腈（ACN），N-甲基吡咯烷酮（NMP），甲苯]中進行篩選，結果顯示相對于相同起始濃度進行的大量反應進行30分鐘。在ACN（35×）和甲苯（100×）中反應加速很明顯。雖然電噴霧實驗是在不同的溶劑中進行的，但在所有實驗中分析之前的最后提取操作都是在ACN中進行的。

圖2 在甲苯和乙腈（ACN）體系中對于N-乙?；磻腗S分析

第一步的流動反應條件篩選也從溶劑篩選開始。NMP和DMF表現不佳，轉化率有限，雜質較多。在甲苯中，氯化反應發生得很快，轉化率很好，而在ACN中，觀察到由SN2反應途徑產生的副產物（5，7）的形成（圖2）。除了溶劑，也對溫度和反應時間進行了篩選。隨著溫度的升高，在大多數情況下，由于副反應越來越多，轉化率變底。通過將氯乙酰氯更換為溴乙酰氯，作者找到了副反應發生的機理證據。使用溴乙酰溴的N-?；磻念A期產物的分子量為367；但是，在m/z 322處看到了一個額外的峰。這證實了在N-酰化過程中溴而非氯的損失。通過柱色譜分離出SN2和N-?；a物的混合物（來自流動實驗），核磁共振分析顯示，在3.7和3.9 ppm處有兩組不同的峰，分別對應于N-乙?；蚐N2產物的亞甲基質子（圖3）。根據上述觀察，我們確定甲苯是連續合成地西泮的最佳溶劑。

圖3 SN2反應和N-乙?；磻a物混合物的亞甲基質子的1H NMR信號

除此SN2產物外，在流動實驗中還觀察到m/z 288處的峰，與環閉合的產物一致。作者認為，這種m/z 288化合物（分子量287）是是由于SN2反應后，羰基對酰氯的親核攻擊形成七元環狀內酯的產物。實驗結果表明，在微流體系統中，反應溶劑和鹵化物的選擇可以對反應結果起到控制作用。值得注意的是，這些副反應的結果在微流體實驗中觀察到，但在相應的液滴實驗中卻沒有。這是由于微流控反應中需要高溫和高壓條件，但液滴反應卻不需要，原因可能是副反應需要更高的能量。

環化反應篩選：對環化反應的預篩選顯示，在萊登弗羅斯特液滴中形成地西泮需要更高濃度的氨（圖4）。在這些液滴反應中可以觀察到反應的加速。在嘗試兩步連續流地西泮合成之前，首先對先前制備的N-?；a物3A的第二步進行了微流體篩選。對每種溶劑，篩選其不同的反應溫度和反應時間。該物質在ACN和甲苯溶解度小于250μM，但在該濃度下在NMP中溶解良好。幸運的是，在NMP中地西泮的轉化效果很好。在研究這一步驟時，另一個有趣的現象是在m/z 303處出現質譜峰。這可能代表甲基位置發生了氮的取代。由于在較低的溫度和反應時間中MS中出現這一峰，在較高的溫度下消失，所以說這可能是地西泮合成的中間產物。LC-MS分析表明，在整個溫度和反應時間篩選中實驗中，即使地西泮的數量穩步增加，這種m/z 303的物質的數量也依舊保持相對恒定，這有可能是由于m/z 303的物質的高電離效率淹沒了反應混合物中其他化合物的信號。該m/z 303的物質（6）也被認為是地西泮合成中的水解產物。

圖4 環化反應篩選中在ACN和甲苯溶劑中使用溴乙酰氯對地西泮合成的結果比較

連續流地西泮合成：作者通過根據上述的實驗結果，進而對地西泮合成路線中的每一個合成步驟有了更全面的了解。這些可能的反應途徑總結在圖5中。在篩選的指導下，作者接下來嘗試通過兩個連續步驟優化地西泮的合成。通過使用了一個Two-chip反應器系統來更好地控制每個chip的溫度和反應時間。第一chip分別以1:2的比例（圖6、R1和R2）將5-氯-2-（甲胺基）二苯甲酮和鹵代乙酰氯組合在一起，然后將所得N-酰化產物混合物（R3）與甲醇稀釋并隨后在第二chip中以7倍的過量添加氨/甲醇（R4）。

圖5 在地西泮合成中可能存在的一些副反應途徑

溶劑篩選再次受到溶解度的限制，尤其是在第二步中添加氨/甲醇時。為了緩解這一問題，在第一反應步驟后加入稀釋步驟以提高溶解度。第一步使用甲苯，用甲醇或NMP稀釋1:4，可獲得良好的溶解性。第一步使用ACN和稀釋也是有效的。與之前的流動反應的篩選一樣，作者改變了溫度和反應時間，以及溴乙酰氯和氯乙酰氯的選擇。這次篩選的結果證實了作者以前的觀察，特別是在ACN中使用溴乙酰氯容易產生了一些SN2產物。此外，使用溴乙酰氯時，從中間體到地西泮的總轉化率較高。

圖6采用Chemtrix Labtrix S1全自動微通道連續流反應器兩步連續流合成地西泮的裝置系統示意圖

每個反應的產率使用定量ESI-MS/MS方法進行測定。采用ESI-MS定量方法，在甲苯/甲醇溶劑體系中使用溴乙酰氯，最終以100%產率獲得地西泮。這也是Leidenfrost和噴霧微滴中的最佳溶劑體系。

實驗結論

1.本研究以地西泮合成為模型反應，展示了MS分析和液滴反應對微流體合成的指導作用。MS不僅可以作為一種分析工具，而且可以作為一種快速預測反應和指導微觀合成的方法。

2.使用噴霧和萊登弗羅斯特液滴反應作為篩選中的一步，以指導更大規模的微流體篩選的策略，用于預測反應的總體結果是有效的。雖然在液滴實驗的結果與流動反應中所觀察到的有一些細微差別，但這些實驗仍然可以提供給我們反應是否可行的信息。

3.通過在微流控反應器中分兩步連續合成地西泮。其特點是使用混合溶劑系統，以及按順序排列的兩個微流控芯片，從而在每個步驟實現對溫度控制的優化。

4.文中涉及微反應采用荷蘭Chemtrix 公司的Labtrix S1 自動微反應系統中3223和3224配置執行。

5.作者還發現了地西泮合成中在之前未知的副反應途徑。這些結果展示了微流體合成與快速ESI-MS分析相結合的可能性，以識別先前未知的反應途徑并指導優化原料藥的連續合成。

參考文獻

Org. Process Res. Dev. 2017, 21, 1566?1570

公司簡介：

深圳市一正科技有限公司，作為荷蘭Chemtrix公司（微通道反應器）、英國AM公司（連續攪拌多級反應器、催化加氫系統）、英國NiTech公司（連續結晶儀、連續合成儀）在中國區的獨家代理商和技術服務商，為廣大高校和企業提供連續合成、在線萃取、連續結晶、在線過濾干燥、在線分析等整套連續工藝解決方案。

公司與復旦大學、南京大學、中山大學、華東理工大學、南京工業大學、浙江工業大學、河北工業大學等高校研究機構合作成立微通道連續流化學聯合實驗室，致力于推動連續流工藝在有機合成、精細化工、制藥行業、能源材料、食品飲料等領域的應用，合作實驗室可以為客戶的傳統間歇釜式工藝在連續流工藝上的轉變提供工藝驗證、連續流工藝開發工作，促進制藥及精細化工企業由傳統間歇工藝向綠色、安全、快速、經濟的連續工藝轉變。

公司與荷蘭Chemtrix B.V.在浙江臺州、江蘇南京合作組建了連續流微通道工業化應用技術中心（以下簡稱“工業化技術中心”），旨在打造集連續流微通道工藝開發、中試試驗、工業化驗證、技術交流于一體的綜合性連續流微通道應用技術服務中心，以為廣大生物醫藥企業、化工類企業提供專業、完善的智能化連續流工藝整套系統解決方案及一流的技術服務方案。

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